Basé à Catterick et équipé de Spitfire en septembre 1939, le Squadron 41 reste stationné sur cette base jusqu'en mai 1940, époque à laquelle il fait mouvement vers le Sud, à Hornchurch pour prendre part aux opérations de couverture à l'occasion de l'opération "Dynamo" consistant à évacuer le corps expéditionnaire Britannique à Dunkerque. Le Squadron retourne à Catterick le 26 juillet et repart pour Hornchurch pendant 2 semaines. Après un retour à Catterick, un troisième séjour à Hornchurch est réalisé de septembre 1940 à février 1941.

En novembre 1940, les Spitfire IIa remplacent les Spitfire Mk I. De retour à Catterick, le Squadron change encore de base et s'installe à Merston en juillet 1941 où des Spitfire Vb sont réceptionnés. Le Squadron effectue ensuite une série de transfert et participe aux opérations trans-Manche typiques de cette époque. En février 1943, il est le premier Squadron à recevoir le Spitfire XII à moteur Griffon et en avril, le Squadron s'installe à Hawkinge pour ffectuer des opérations d'attaque à basse altitude à travers la Manche.

Pendant les 18 mois suivants, le Squadront effectue une série de monuvement et participe à la défense de la Grande Bretagne en interceptant les chasseurs bombardiers allemands qui attaquent l'Angleterre. Après avoir participé au débarquement de Normandie, le Squadron est affecté à la chasse aux V1 et en septembre il reçoit des Spitfire XIV avec lesquels le Squadron est affecté à l'escorte des bombardiers qui s'enfoncent toujours plus profondemment au coeur de l'Allemagne.

En décembre, le Squadron rejoint la 2nd TAF en Belgique et en janvier 1945 il intègre le Wing 122 afin d'assurer la couverture des Tempest. Le Squadron se montre très actif au cours de cette période et lorsque la guerre se termine le Squadron compte plus de 200 victoires confirmées et 170 probables.